Formula terbaik pada fiksasi histotehnik udang

Metode fiksasi yang tepat merupakan metode yang paling penting dalam mempersiapkan  preparat histologi udang. Fiksasi yang tidak tepat akan menyebabkan misinterpretasi pada jaringan. Hal yang perlu diperhatikan adalah beberapa jaringan udang lebih cepat terautolisis dibandingkan jaringan hewan lainnya. Oleh karenanya perendaman saja tidak cukup, harus dilakukan injeksi pada area –area tertentu 

Udang

Udang yang dipergunakan untuk histologi adalah udang yang mati segar, sekarat. Udang mati hampir selalu tidak dapat digunakan untuk histologi.

·     Larutan Fiksatif

Larutan fiksatif yang digunakan untuk histologi udang ada beberapa seperti Helly’s, Bouin’s, 10% NBF, dan  larutan Davidson’s AFA. Larutan Davidson’s secara umum digunakan dan terbaik untuk udang penaeid.  Larutan ini dapat dibuat dengan bahan sebagai berikut:

95% etanol/ etanol absolut                       330mL

Formaldehyde (37-40%) teknis                  220mL

Asam asetat glacial                                 115mL

Akuades                                                  335mL

Alternatif

Alkohol 50%                                       62,7mL

Formalin 37%                                     22mL

Asam asetat glacial                           11,5mL

Akuades                                            3,8mL

Isopropil alcohol dapat digunakan sebagai pengganti etanol, namun hasilnya tidak terlalu baik.

Asam asetat glacial tidak dapat diganti dengan asam yang lain sebab bahan ini berfungsi mendekalsifikasi eksoskeleton dan hal ini sangat membantu pada saat melakukan irisan jaringan. Larutan Davidson’s juga dapat digunakan untuk fiksatif pengujian lain seperti In Situ Hibridisasi. Deteksi virus RNA tidak dapat dilakukan pada organ yang difiksasi dengan larutan Davidson’s sebab RNA nya hancur dengan larutan ini. Disamping itu formalin dalam larutan ini dapat mengganggu proses PCR. Hal yang perlu diperhatikan adalah larutan Davidson’s sangat kuat, hindari kontak dengan kulit dan mata.  

Larutan fiksatif lain seperti neutral buffer formalin 10% dapat digunakan. Namun, penggunaan larutan ini akan menghasilkan gambaran sel dan jaringan yang berbeda dengan fiksasi menggunakan Davidson’s.

Ketentuan  Fiksasi

a.    Udang berukuran kecil (larva, PL awal (<PL5)):

masukkan secara langsung ke dalam fiksatif  perbandingan 1:10 selama 12-24 jam

b.    Udang berukuran besar (PL besar, juvenil, dewasa)

Injeksi larutan fiksatif (0,1-5mL) pada hepatopankreas, lambung, dan midgut pada segmen 2-4. Jumlah larutan yang diinjeksikan bergantung ukuran spesimen. Sebagai panduan, injeksikan kurang lebih 5-10%  dari berat badan udang (0,1mL fiksatif untuk udang 1 gram; 1mL untuk udang 10 gram; dll). Perubahan warna akan terjadi pada area yang diinjeksi. Kemudian uka kutikula cephlothorax dan abdomen di sisi samping hingga dorsal midline menggunakan gunting.  Rendam dalam larutan Davidson’s selama 48-72 jam

c.    Udang berukuran besar (>12gram)

Setelah injeksi, potong udang menjadi 2-3 bagian untuk udang besar, di perbatasan cephalothorax-abdomen, dan di tengah abdomen

d.   Udang berukuran besar, udang galah, lobster, kepiting

Organ yang akan diperiksa sebaiknya di ambil setelah diinjeksi larutan fiksatif.  Pasca injeksi, organ diiris dan dibagi menjadi 2 hingga 3 bagian. Kemudian spesimen di rendam dalam larutan Davidson’s selama 24-72 jam.  

*Catatan: Hepatopankreas harus memperoleh larutan fiksatif terbanyak daripada abdomen. Pada udang berukuran besar injeksi hepatopankreas baiknya dilakukan pada beberapa titik.  Setelah diinjeksi, direndam dalam larutan Davidson’s perbandingan 1:10

Waktu fiksasi

Fiksasi selama 12-48jam dalam larutan Davidson’s (1:10) dengan ketentuan 12 jam untuk larva dan PL, 24 jam juvenil, 48-72 jam untuk subadult hingga dewasa (tergantung ukuran). Makin besar udang makin lama waktu fiksasi untuk memastikan dekalsifikasi eksoskeleton. Lewat dari waktu tersebut dipindahkan ke dalam alcohol 50-70%.

Hal yang perlu diperhatikan dalam waktu fiksasi adalah, harus dilakukan sesegera mungkin setelah udang diambil dari air. Tidak diperkenankan udang tersebut dibawa dalam es atau dengan wadah tertentu untuk dibawa ke tempat fiksasi. Udang harus dibawa dalam kondisi hidup hingga ke lokasi untuk fiksasi.

·            Transportasi sampel

          Spesimen berukuran besar yang akan ditransportasikan harus dibungkus dengan tisu atau kain yang dibasahi alcohol 70% dan dikemas dengan plastik ganda.  Udang kecil bisa dimasukkan ke dalam vial atau tube kecil dan dikemas dengan plastik. Pelabelan harus menggunakan pensil.

Referensi

Alaya de Graindrage, V. dan Flegel, T.W. 1999. Diagnosis of shrimp diseases, with emphasis on the black tiger shrimp (Penaeus monodon). FAO: Roma

Bondad-Reantaso, M.G., McGladdery, S.E., East, I., and Subasinghe, R.P. (eds.)Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases.FAO Fisheries Technical Paper No. 402, Supplement 2. Rome, FAO. 2001. 240 p.

Course The University of Arizona Department of Veterinary Science and Microbiology Aquaculture Pathology 2009

Lightner, D.V (Ed). 1996. A Handbook of Shrimp Pathlogy and Diagnostic Procedures For Diseases of Cultured Penaeid Shrimp. The World Aquaculture Society

OIE.2016. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals - Chapter 2.2: Disease of Crustacean.